Proizvodnja β-nikotinamid mononukleotida (NMN) u Escherichia coli

Sažetak

Dijabetes je kronična i progresivna bolest s neprestano rastućom rasprostranjenošću, sve većim financijskim pritiskom na svjetske zdravstvene sustave. Nedavno je inzulinska rezistencija, koja je oznaka dijabetesa tipa 2, izliječena na miševima liječenim NAD ⁺ prekursor -n-nikotinamid mononukleotidom (NMN) , a nisu zabilježeni toksični učinci. Međutim, NMN ima visoku cijenu, potrebne su ekonomičnije metode proizvodnje. Ovo istraživanje predlaže biotehnološku metodu proizvodnje NMN-a u Escherichia coli . Pokazujemo da bikrosronska ekspresija rekombinantne nikotinamid fosforibosil-transferaze (Nampt) i fosforibozil-pirofosfat (PRPP) sintetaza u prisustvu nikotinamida (NAM) i laktoze može biti uspješna strategija za isplativu proizvodnju NMN-a. Proteinski ekspresijski nosioci NAMPT gena iz Haemophilus ducreyi i PRPP sintetaza iz Bacillus amyloliquefaciens sa mutacijom L135I transformirani su u Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Proizvodnja NMN dosegla je maksimalno 15,42 mg po L bakterijske kulture (ili 17,26 mg po gramu proteina) u tim stanicama uzgojenim u mediju PYA8 uz dodatak 0,1% NAM i 1% laktoze.

Uvod

Prema podacima Međunarodne federacije za dijabetes, broj odraslih s dijabetesom tipa 2 u 2017. godini iznosio je 425 milijuna, a očekuje se da će dostići 649 milijuna do 2045. Na globalnoj razini troši se 12% proračuna za zdravstvo (ili 727 milijardi USD) o liječenju dijabetesa. Nedavne studije povezane su s inzulinskom rezistencijom, zaštitnim znakom dijabetesa tipa 2, padom mitohondrijske funkcije i smanjenjem razine NAD ⁺ , kao i omjerom NAD ⁺ / NADH, također primijećenim u starenju. NAD ⁺ prisutan je u svim živim organizmima i dobro je poznat koenzim u oksidacijsko-redukcijskim reakcijama. NAD ⁺ ovisne proteinske deacetilaze poput SIRT1 i SIRT6 služe kao metabolički senzori i reguliraju nizvodne puteve, koji na kraju vraćaju mitohondrijsku funkciju i osjetljivost na inzulin. Ovo otkriće proširuje područje istraživanja NAD ⁺ učinaka na ostale degenerativne bolesti povezane sa starenjem, kao što su: kardiovaskularni, rak, artritis, osteoporoza ili Alzheimerova bolest.

Mononukleotid β-nikotinamida (NMN) intermedijer je u biosintezi NAD ⁺ proizvedenoj iz nikotinamida (NAM) i fosforibozil-pirofosfata (PRPP) enzimom nikotinamid fosforibosil-transferaze (Nampt) (EC 2.4.2.12). Budući da se dobro podnosi, bez prijavljenih nuspojava tijekom dugotrajne primjene na miševima i sprečavajući fiziološki pad vezan uz dob, NMN se pokazao učinkovitim u liječenju dijabetesa tipa 2 izazvanog visokom masnoćom, preokrećući mitohondrijsku disfunkciju povezanu sa starenjem i spašavajući učinak smanjenja neuronskih matičnih stanica povezanih sa starenjem.

NAM se obično pretvara u NMN enzimima koji su uključeni u NAD ^{+ put} spašavanja, kao što je Nampt. Djelovanje ovog enzima čini glavnu NAD ⁺ anaboličku aktivnost u stanici. Regulacija nukleotidnog metabolizma sisavaca ili mikroorganizama obično se odvija konzumiranjem PRPP. PRPP nastaje iz riboze-5-fosfata preko oksidativnih i neoksidativnih grana na putu pentoznog fosfata.

U bakterijama NAM se najčešće pretvara u nikotinsku kiselinu (NA) pomoću nikotinamidaze koja je integrirana u put Preiss-Handler, a to je slučaj i s Escherichia col . U sisavaca nije zabilježena aktivnost nikotinamidaze; Umjesto toga, NAM se pretvara u NMN pomoću jednog od NAM enzima fosforibozil-transferaze. Iako većini bakterija nedostaje NAM fosforibosil-transferaza, enzim je eksprimiran u Haemophilus ducreyi i Shewanella oneidensis .

Jednostavni i metabolički svestrani organizmi, poput Escherichia coli , često se koriste u biotehnologiji za kontroliranu ekspresiju proteina sa željenom enzimskom aktivnošću. DNA kodiranje takvih enzima često se unosi u bakterije ekspresijskim vektorima, poput pET sustava iz Novagena. PET vektori se transformiraju u bakterije koje eksprimiraju T7 RNA polimerazu, poput E. coli BL21 (DE3). Kontrola ekspresije enzima postiže se korištenjem lac promotora, koji uključuje ekspresiju samo u prisutnosti laktoze (koja se također metabolizira kao izvor ugljika) ili njezinog sintetičkog strukturnog analoga, izopropil-l-tio-β-D-galaktopiranozida (IPTG) ( ne metabolizira, s konstantnom koncentracijom tijekom procesa rasta). Kako je metabolički metabolizam svestran, varijacija izvora ugljika i koncentracija enzima supstrata sa dodatkom medija ključni su čimbenici koje treba uzeti u obzir u biotehnološkom procesu.

U namjeri da riješimo trenutni problem visokih cijena NMN-a , u našem prethodnom radu predložili smo metodu pročišćavanja iz bakterijskih stanica. Za daljnju optimizaciju procesa, kako smo uspjeli pronaći samo jednu metodu proizvodnje kvasca, ovo istraživanje predlaže jednostavnu i ekonomičnu metodu biotehnološke proizvodnje NMN u Escherichia coli .

Rezultati

Bakterijska transformacija

Poravnavanje višestrukih aminokiselinskih gena za pretpostavljeni NadV iz Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 i Nampt iz Mus musculus , pokazuje veliku sličnost (slika S1), što sve ove enzime čini kandidatima za biotehnološki proces.

Preobraženi E. coli stanice s nadV (NAMPT) genima koje nose pET28a (+) plazmidi formirali su kolonije na LB Agar pločama nadopunjenim kanamicinom. Nisu otkrivene kolonije na pločama inokuliranim netransformiranim bakterijskim stanicama. Agarozna gel elektroforeza plazmidne DNA izolirana iz ovih kolonija potvrdila je prisutnost plazmida Nampt-PET28a, pET28a-soNadV ili pET28a-hdNadV u E. coli DH5α (Dopunska slika S2A, traka 2, 3, 4). DNA vrpce odgovaraju granicama od E. coli BL21 (DE3) pLysS stanice (dopunska slika S2A, traka 6, 7, 8), koje su transformirane odgovarajućim plazmidima izdvojenim izravno iz E. coli DH5α. U netransformiranom E. coli BL21 (DE3) pLysS ćelije, korištene kao negativna kontrola, prisutnost pLysS plazmida potvrđena je elektroforezom, pojava koja odgovara poznatoj dužini od 4886 bp (dopunska slika S2A, traka 5) prikazana je na agaroznom gelu.

(Za dodatne eksperimentalne podatke, pogledajte izvornu web stranicu: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)