Četiri ključna elementa i razvojni trendovi razvoja ADC lijekova

ADC (antitijelo-lijek konjugati) tehnologija je povezati monoklonalna antitijela i molekule lijekova zajedno putem veznika, koristiti specifično ciljanje protutijela za transport molekula lijeka na ciljna tkiva, smanjiti sistemske toksične nuspojave lijekova, poboljšati prozor liječenja lijekovima. Proširite potencijal terapije protutijelima [1]. Nakon što se ADC koji cirkulira u krvi veže na ciljni antigen, internalizira ga endocitoza posredovana klatrinom. Internalizirani kompleks tada ulazi u put endosom-lizosom i u većini slučajeva prvo se transportira do ranih endosoma, a potom do lizosoma. Kisela okolina i proteolitički enzimi uzrokuju razgradnju lizosoma koji sadrže ADC te tako oslobađaju citotoksične lijekove u citoplazmu. Oslobođeni citotoksični lijek istječe u citoplazmu i izaziva apoptozu umetanjem DNK ili inhibicijom sinteze mikrotubula. Stoga su ispravna meta, antitijela, veznik i citotoksični teret postali četiri ključna faktora koji utječu na ADC lijekove.

1. Ključna četiri elementa ADC lijekova

1.1 Odabir ispravnog cilja

Uspješan razvoj ADC ovisi o specifičnom vezanju antitijela na ciljni antigen. Idealni cilj ADC je visoka ekspresija na površini tumorskih stanica, niska ekspresija ili nikakva ekspresija u normalnim tkivima, ili barem ograničena na specifična tkiva, kao što su CD138, 5T4, mezotelin, leukemija i CD37. Ciljevi izraženi u normalnim tkivima gutaju ADC lijekove, što ne samo da dovodi do&"GG" izvan cilja; toksični učinci, ali također smanjuje dozu ADC-a obogaćenu u tkivima raka i smanjuje prozor liječenja ADC-om.

Učinkovita ADC aktivnost povezana je s brojem antigena na staničnoj površini. Studije su pokazale da su za postizanje učinkovite ADC aktivnosti potrebna najmanje 104 antigena na staničnoj površini kako bi se osiguralo da se smrtonosna doza citotoksičnih lijekova dovede u stanicu. Zbog ograničenog broja antigena na površini tumorskih stanica (prosječni broj antigena po staničnoj površini je oko 5.000 do 106), a većina kliničkih stadija ADC ima prosječnu DAR od 3,5 do 4, pa se lijekovi ADC isporučuju u stanice tumora. Jako malo. To se također smatra jednim od glavnih razloga kliničkog neuspjeha ADC-a u kombinaciji s uobičajenim citotoksičnim lijekovima poput metotreksata, paklitaksela i antraciklinskih antibiotika.

Uz specifičnost i dovoljnu ekspresiju, optimalni ciljni antigen također bi trebao uzrokovati učinkovitu internalizaciju ADC-a. Vezanje antitijela na površinski antigen ciljne stanice može potaknuti internalizacijski put antitijelo-antigenski kompleks u stanicu, čime se postiže intracelularna isporuka lijeka.

Trenutno je antigen površinske diferencijacije leukocita prvi široko korišteni cilj ADC-a. Trenutno 20 lijekova ADC-a u fazi kliničkog razvoja imaju 10 meta (CD33, CD30, CD79b, CD22, CD19, CD56, CD138, CD74) na površini antigena leukocita. Mnogi ADC lijekovi u velikoj mjeri ciljaju površinske antigene leukocita, jer su ti antigeni visoko eksprimirani u tumorskim tkivima, nisu izraženi u normalnim hematopoetskim tkivima ili su izraženi na ekstremno niskim razinama.

Pored toga, postupno je pronađeno da su neke solidne molekule površinskih receptora tumora pogodne kliničke ADC mete, poput PSMA na raku prostate, receptora epidermalnog faktora rasta EGFR i tkiva karcinoma jajnika, nektina 4 i drugih ADC lijekova koji su ušli u kliničku fazu II. Kadcyla je FDA odobrio 2013. godine sa ciljem HER2. U 2019. godini Padcev koji je FDA odobrio s ciljem NECTIN4 drugi je cilj lijeka ADC odobren za liječenje solidnih tumora.

1.2 Odabir antitijela

Visoka specifičnost molekula antitijela osnovni je zahtjev za postizanje učinkovitosti ADC lijekova, tako da se koncentrira citotoksično sredstvo na mjestu tumora. Oslanjajući se na antitijela specifična za visoki afinitet, osim što izbjegavaju toksičnost na zdrave stanice, krvožilni sustav može eliminirati antitijela kojima nedostaje specifičnost tumora, što uzrokuje da lijekovi ADC do&"iscrpe GG"; prije nego što dođe do tumorskog tkiva. Iz tog razloga, citotoksični lijekovi su obično vezani za Fc dio ili konstantno područje mAb da se spriječi otkrivanje i vezanje antigena.

Kako ove molekule protutijela od 150kDa sadrže ne samo više prirodnih mjesta za konjugaciju, već se mogu i modificirati za druga reakcijska mjesta, sva ADC antitijela trenutno su IgG molekule. Prednost molekule IgG je njezin visoki afinitet za ciljni antigen i duži poluživot u krvi, što dovodi do povećanog nakupljanja na mjestu tumora. U usporedbi s drugim molekulama IgG, IgG1 i IgG3 imaju mnogo jaču citotoksičnost ovisnu o antitijelima (ADCC) i citotoksičnost ovisnu o komplementu (CDC), ali budući da IgG3 ima kraći poluživot, nije idealan izbor za lijekove ADC. Pored toga, u usporedbi s IgG2 i IgG4, zglob koji tvori IgGl u stanici lako je smanjiti, pa je teško proizvesti ADC lijekove na temelju proizvodnje cisteina. Stoga, budući da IgG1 ima relativno jak ADCC i CDC, dug poluživot i laku proizvodnju, većina ADC lijekova trenutno se izrađuje pomoću IgG1 skela [3].

Imunogenost ADC-a jedna je od glavnih odrednica razdoblja poluživota u cirkulaciji. Rani ADC-i koristili su mišja monoklonska antitijela da izazovu snažan, akutni imunološki odgovor (HAMA) u ljudskom tijelu. Trenutno većina ADC-a koristi humanizirana antitijela ili potpuno humanizirana antitijela.

Općenito, idealan mAb za ADC arhitekturu trebao bi biti humanizirani ili potpuno humanizirani molekul IgGl koji se može selektivno vezati na tumorske stanice bez unakrsne reakcije sa zdravim stanicama. Uz to, internalizacija ADC-a može biti važan faktor, a ne apsolutni faktor za uspješno liječenje.

1.3 Odabir molekule toksina (korisni teret)

Molekule toksina ključni su faktor uspjeha razvoja ADC lijekova. Samo mali dio antitijela ubrizganih u tijelo akumulira se u čvrstim tumorskim tkivima, pa je prvo imati sub-nanomolarne toksične molekule (IC50 vrijednost 0,01-0,1 nM). Odgovarajuće korisne nosivosti. Pored toga, toksične molekule moraju imati prikladne funkcionalne skupine koje se mogu povezati, imaju jaku citotoksičnost, hidrofobne su i vrlo stabilne u fiziološkim uvjetima.

Toksične molekule koje se trenutno koriste za razvoj lijekova za ADC mogu se podijeliti u dvije kategorije: inhibitore mikrotubula i DNA koji oštećuju DNK, a ostale male molekule poput α-amanitina (selektivni inhibitori RNA polimeraze II) također su proučavane [12]. Prvu su predstavljali MMAE i MMAF (besplatni lijek IC50: 10-11-10-9M) iz Seattle's Genetics-a i DM1 i DM4 (besplatni lijek IC50: 10-11-10-9M) koji su razvili ImmunoGen 's. Potonji je predstavljen kalihemicinom, duokarmicinima i spirogenom PBD (besplatni lijek IC50< 10-9m).="" ovi="" toksini="" imaju="" odgovarajuće="" adc="" lijekove="" koje="" treba="" istražiti="" i="" razviti="" u="" kliničkoj="" fazi.="" mnoge="" tvrtke="" također="" razvijaju="" vlastite="" korisne="" opterećenja,="" poput="" nerviano="" medical="" sciences,="" mersanatherapeutics="" i="" drugih="">

1.4 Odabir povezivača

Iako je važno odabrati specifična antitijela i korisne nosivosti prema vrsti tumorskih stanica, u smislu farmakokinetike, farmakologije i terapijskog prozora, odabir odgovarajućih povezivača za ograničavanje protutijela i korisnog opterećenja je ključ za uspješnu izgradnju ADC-a. Idealni veznik Moraju biti zadovoljeni sljedeći uvjeti: (1) Linker mora biti stabilan u sustavu cirkulacije krvi i može brzo otpustiti aktivne korisne nosivosti kada se nalazi u ili blizu tumorskih stanica. Nestabilnost veznika dovest će do prevremenog oslobađanja korisnog opterećenja, što će rezultirati normalnim tkivima. Oštećenja stanica. Postoji i klinička studija koja pokazuje da je ADC stabilnost baršunastih alkaloida obrnuto povezana s nuspojavama. Stoga je za kombinaciju antitijela, tumorskog tkiva i korisnog opterećenja vrlo važno odrediti veznik s najboljom stabilnošću. (2) Jednom kada se ADC internalizira u ciljno tkivo tumora, veznik mora imati mogućnost brzog cijepanja i oslobađanja toksičnih molekula. (3) Hidrofobnost je također važna značajka koju povezivač ima. Hidrofobne skupine koje povezuju i hidrofobne korisne nosivosti obično potiču agregaciju malih molekula ADC-a, uzrokujući tako imunogenost.

Veziva se trenutno dijele u dvije kategorije: jedan je veznik koji se može cijepiti (veznici koji se razgrađuju kiselinom, veznici koji se mogu cijepiti proteazom, disulfidni povezivači), glavna vrsta ADC lijekova; drugi su veznici koji se ne mogu cijepiti, a razlika je u tome je li u njemu degradiran unutar ćelije.

Veziva koja se mogu cijepati dizajnirana su tako da iskoriste razlike u okruženju krvnoga sustava i tumorskih stanica. Na primjer, veznici osjetljivi na kiselinu obično su vrlo stabilni u krvi, ali su nestabilni u lizosomima s niskim pH i brzo se razgrađuju, oslobađajući slobodnu aktivnu toksičnu molekulu (Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin)). Slično tome, veznici koji se mogu cijepati proteazama osjetljivi na proteaze su stabilni u krvi, ali u lizosomima bogatim proteazama (prepoznajući njihove specifične proteinske sekvence), oni se brzo cijepaju da bi oslobodili aktivne toksične molekule, baš kao i Val-Cit. Veza se brzo hidrolizira intracelularnim katepsini (Adcetris (brentuximab vedotin)). Dizajnirani disulfidni umreženi veznik koristi ekspresiju unutarstanične reduciranog glutationa, a reducirana disulfidna veza oslobađa toksične molekule (IMGN-901 (anti-CD56-majtansin)) u stanici.

Veziva koja se ne mogu cijepiti sačinjena su od stabilnih veza otpornih na propadanje proteaze i vrlo je stabilna u krvi. Oslanja se na komponente ADC antitijela koje će se potpuno razgraditi citoplazmom i lizosomalnim proteazama i konačno oslobađa korisnog opterećenja povezanog s aminokiselinskim ostacima dobivenim iz degradiranog antitijela da ubiju stanice raka (npr. Ado-trastuzumab emtansin, T-DM1 ili Kadcyla). U isto vrijeme, ADC lijekovi koji ne mogu cijepiti linker ne mogu se oslobađati izvanstanično i ne mogu ubiti stanice raka u blizini&"efektom promatrača GG".

Naravno, izbor vrste povezivača usko je povezan s odabirom cilja. Među lijekovima ADC s vezom koji se može cijepiti, mete su antigeni B stanica (CD19, CD20, CD21, CD22, CD79B, CD180), koji su se pokazali vrlo učinkovitim in vivo. Suprotno tome, u lijekovima ADC s vezama koje se ne može otkloniti, ciljevi za koje je dokazano da su endocitozirani in vivo i brzo se transportiraju u lizosome uključuju CD22 i CD79b.

Krajnji je cilj Linker-a osigurati specifično oslobađanje slobodnih lijekova u stanicama tumora, a kontrola toksičnosti lijeka je također vrlo važna. Na kraju, potrebna je analiza svakog slučaja da se odluči kako optimalno odabrati odgovarajuću vezujuću, ciljnu i molekulu otrova kako bi se izbalansirala učinkovitost i toksičnost ADC lijekova.

2. Povijest razvoja lijekova protiv ADC-a vidi promjene četiri temeljna elementa

Razvoj onkoloških lijekova može se pratiti do sredine dvadesetog stoljeća. Otkriveno je da dušični senfi uništavaju pojedinačna koštana srž i limfoidna tkiva ciljajući na brzo dijeljenje stanica karcinoma. Takvi lijekovi uključuju folnu kiselinu i analoge purina (metotreksat i 6-merkaptopurin), inhibitore / promotore polimerizacije mikrotubula (vinka alkaloidi i taksani) i uništavače DNA (antraciklini i dušik) senf) [2]. Budući da lijekovi za rano liječenje raka nisu samo ciljali stanice karcinoma, već su imali i ubijajući učinak na sve stanice koje dijele u tijelu, što je dovelo do ozbiljnih nuspojava kod pacijenata, ovo je uvelike ograničilo doziranje lijeka i terapijski indeks lijeka (maksimalno tolerirano doza / minimalna učinkovita doza) je vrlo mala, prozor liječenja je uzak. ADC lijekovi mogu omogućiti selektivnu dostavu toksičnih spojeva specifičnim stanicama raka.

2.1 Lijekovi ADC prve generacije

Među ADC lijekovima prve generacije, antitumorski lijekovi kao što su mitomicin C, idarubicin, antraciklini, N-acetil melfalan, doksorubicin, vinka alkaloidi i metotreksat uglavnom prolaze kroz molekul koji se ne može cijepiti (amid ili sukcinimid) povezan s mišjim monoklonalom antitijelo.

2000. godine, američka FDA odobrila je prvi lijek konjugiran na antitijela Gemtuzumab Ozogamicin (trgovački naziv Mylotarg, Wyeth, podružnica Pfizera). Cilj je bio CD33. Gemtuzumab Ozogamicin sastoji se od tri dijela: 1) rekombinantni humanizirani IgG4 kappa monoklonalni antitijelo Gemtuzumab; 2) Citotoksični N-acetil gama kaliheamicin; 3) Tip kiselinskog odvajanja koji se sastoji od 4- (4-acetilfenoksi) -butanske kiseline (AcBut) i 3-metil-3-merkaptobutan hidrazida (dimetilhidrazid) funkcionalne molekularne veze. Molekula Linker kovalentno povezuje kaliheamicin s monoklonskim antitijelom, a omjer lijek-antitijelo ADR u prosjeku iznosi 2 do 3. Nakon što ga ciljne stanice endocitoziraju, lijek oslobađa kaliheamicin hidrolizom veznika, izazivajući dvolančani prekid DNK, što rezultira zaustavljanjem staničnog ciklusa i apoptoza. Ovaj lijek se koristi za liječenje akutne mijeloidne leukemije pozitivne na CD33.

Kasnije je ustanovljeno da Gemtuzumab Ozogamicin nema značajne kliničke prednosti u usporedbi s drugim lijekovima protiv raka, te ima jaku toksičnost na jetri. U 2010. godini, 10 godina nakon uvrštenja u promet Gemtuzumaba Ozogamicina, preuzela je inicijativu za povlačenje s tržišta. Potencijalni nedostaci liječenja Gemtuzumab Ozogamicinom uključuju nestabilnost veznika, oslobađanje 50% kemijskog lijeka u oko 48 sati; kaliheamicin u lijeku je visoko hidrofoban, stopa vezivanja s monoklonskim antitijelom je 50%, toksičnost je velika, CMC loš. Pored toga, postoje studije koje pokazuju da se monoklonsko antitijelo Gemtuzumab može očistiti iz stanica pomoću pumpi za ispuštanje (MDR1 i MRP1) i nema značajan klinički učinak u usporedbi s drugim lijekovima protiv raka.

2.2 Druge generacije ADC lijekova

Nakon gotovo 10 godina brzog razvoja monoklonskih lijekova protutijela, i učinkovitijih lijekova protiv malih karcinoma otkriveno je (100-1000 puta). ADC lijekovi druge generacije imaju bolja CMC svojstva od ADC lijekova prve generacije. Predstavnici lijekova druge generacije uključuju Brentuximab vedotin, Ado-trastuzumab emtansin, Inotuzumab Ozogamicin.

Međutim, lijekovi druge generacije imaju uski terapeutski prozor. Glavni razlog je taj što imaju malu off-target toksičnost i natječu se sa nevezujućim antitijelima lijekova male molekule za tumorske mete. Druga generacija ima različite omjere protutijela na lijekove (DAR) 0-8. Obično DAR prelazi 4, pokazat će nisku toleranciju, visoku učinkovitost plazma klirensa i nisku učinkovitost in vivo [3]. Na primjer, Brentuximab vedotin je 4, Ado-trastuzumab emtansin 3,5, a Inotuzumab Ozogamicin 6.

1) Adcetris

Brentuximab vedotin (trgovački naziv Adcetris) zajednički su razvili Seattle Genetics i Millennium (podružnica tvrtke Takeda Pharmaceuticals), a američki FDA odobrio ga je u kolovozu 2011. Cilj je CD30, koji se sastoji od tri dijela: 1) CD30 usmjeren na himerizam Tip IgGl kappa monoklonalno antitijelo Brentuximab; 2) inhibitor mikrotubule MMAE (monometil auristatin E); 3) vezna molekula molekule tipa odvajanja proteaze maleimidokaproil-valil-citrullinil-p-aminobenziloksikarbonil (mc-val-cit-PABC). Linker kovalentno spaja MMAE na monoklonska antitijela kroz cisteinske ostatke, a omjer lijek-antitijelo DAR u prosjeku iznosi 3 do 5. Nakon što Brentuximab vedotin internalizira ciljna stanica, MMAE cijepljeni proteazom može se vezati na tubulin i uništiti stanicu&# 39 s mrežom mikrotubula, što dovodi do zaustavljanja i apoptoze staničnog ciklusa. Indikacije su Hodgkin GG-ov limfom, sistemski anaplastični velikocelijski limfom, limfom plaštne plaštete i mikoza.

2) Kadcyla

Ado-trastuzumab emtansin (trgovački naziv Kadcyla) razvio je Genentech (podružnica tvrtke Roche), a odobrila ga je američka FDA u veljači 2013. Cilj je HER2, koji se sastoji od tri dijela: 1) Trastuzumab koji cilja HER2 Anti; 2) Stabilni tioetrski veznik MCC (4- [N-maleimidometil] cikloheksan-1-karboksilat); 3) Inhibitor mikrotubule DM1 tipa majtansinskog derivata. MCC-DM1 kompleks naziva se emtansin. Prosječni omjer protutijela na lijek je 3,5. Ado-trastuzumab emtansin izaziva zaustavljanje i apoptozu staničnog ciklusa inhibirajući signalni put HER2 i uništavajući mrežu mikrotubula. Indikacija je metastatski karcinom dojke koji je pozitivan na HER2 i primio je najmanje trastuzumab i taksane sami ili u kombinaciji.

3) Besponsa

Inotuzumab Ozogamicin (trgovački naziv Besponsa) zajednički su razvili Pfizer i USB. Odobreno je u Europskoj agenciji za lijekove (EMA) u lipnju 2017., a američka FDA odobrila je u kolovozu 2017. Cilj je CD22, koji se sastoji od tri dijela Sastav: 1) rekombinantni humanizirani IgG4 kappa monoklonalni antitijelo Inotuzumab; 2) N-acetil-gama-kaliheamicin koji može uzrokovati intracelularne dvolančane provale DNA; 3) Kiselina Nestabilna molekula vezujućeg cijepanja, koja je kondenzat koji nastaje 4- (4-acetilfenoksi) -butanska kiselina (AcBut) i 3-metil-3-merkaptobutanehidrazid (također poznat i kao dimetilhidrazid). Molekula povezivača spaja opterećenje N-acetil-y-kaliheamicina na monoklonsko antitijelo. Prosječno korisno opterećenje svakog monoklonskog antitijela je 6, a raspon distribucije 2 do 8. Kada se Inotuzumab Ozogamicin veže na CD22 antigen na B stanicama, on se internalizira u stanice, a citotoksično sredstvo se oslobađa da uništi stanice. Indikacija je monoterapija za liječenje odrasle relapsirane ili vatrostalne CD22-pozitivne B-stanične prekursore akutne limfoblastične leukemije (ALL), pogodna za bolesnike koji su primili barem jedan neuspjeh liječenja inhibitorom tirozin kinaze (TKI) Odrasli bolesnici s relapsom ili refrakternom B - akutna limfoblastična leukemija prekida stanica (SVE) koji su pozitivni na Philadelphia kromosom (Ph +).

2.3 Lijekovi ADC treće generacije

Ključ treće generacije lijekova je vezivanje specifično za mjesto, koje može osigurati lijekove konjugirane antitijelima s jasnim DAR-om. Uz to, optimizacija antitijela, povezivači i lijekovi s malim molekulama mogu značajno poboljšati terapeutski učinak ADC lijekova. Reprezentativni lijekovi su Polatuzumab vedotin, Enfortumab vedotin, Fam-trastuzumab deruxtecan. Kroz specifično vezanje lijekova male molekule na monoklonska antitijela, razvoj lijekova konjugiranih antitijelima s DAR vrijednošću 2 ili 4 nije povećao toksičnost lijeka i nevezana monoklonska antitijela, značajno poboljšao stabilnost lijeka i farmakokinetičku aktivnost lijekova i aktivnost vezanja na stanice s niža razina antigena.

1) Polivy

Polatuzumab vedotin (trgovački naziv, Polivy) odobrio je američki FDA u lipnju 2019. Prvobitno su ga zajednički razvili Genentech (podružnica Rochea) i Seattle Genetics. Kasnije je Sinochem Pharmaceuticals (Roche Holdings) dobio dozvolu za istraživanje i razvoj lijekova. Cilj je CD79b, koji se sastoji od tri dijela: 1) rekombinantno humanizirano IgGl kapppa monoklonsko antitijelo Polatuzumab ciljano na CD79b; 2) mc-val-cit-PABC koji se može cijepati (maleimidokaproil-valil-citrulinil-paminobenziloksikarbonil) Linker; 3) Lijek s malim molekulama MMAE (monometil auristatin E). Antitijelo i MMAE kovalentno su spojeni na cistein preko Linkera. Prosječni DAR bio je 3 ~ 4. Odobreno je za uporabu u kombinaciji s bendamustinom i rituksimabom za liječenje vatrostalnog difuznog oblika. Odrasli pacijent s B-staničnim limfomom.

2) Padcev

Enfortumab vedotin (trgovački naziv, Padcev) zajednički su razvili Agensys (podružnica Astellasa) i Seattle Genetics, a odobrio ga je američki FDA u prosincu 2019. za popis. Cilj je NECTIN4, Enfortumab vedotin sastoji se od tri dijela: 1) rekombinantni humani IgG1 kappa monoklonalni antitijelo Executumab; 2) Molekul molekula koja se može cijepiti mc-val-cit-PABC, naime maleimidokaproil-valil-citrulinil-p-aminobenziloksikarbonilni tip; 3) Lijek s malim molekulama MMAE, monometil auristatin E. MMAE je povezan sa cisteinom monoklonalnih antitijela putem Linker-a, a prosječni omjer lijeka prema monoklonalnom antitijelu DAR iznosi 3,8: 1. Odobreno je za odrasle pacijente koji su prethodno primili PD- 1 ili PD-L1 inhibitori i kemoterapija koja sadrži platinu za lokalno uznapredovali ili metastatski urotelijski karcinom.

3) Enhertu

Fam-trastuzumab deruxtecan (trgovačko ime, Enhertu) odobren je od strane američke FDA u prosincu 2019. godine, a razvio ga je Daiichi Sankyo. Fam-trastuzumab deruktekan je lijek konjugiran na antitijelo HER2 i sastoji se od tri dijela: 1) rekombinantni humanizirani IgG1 kappa anti-HER2 monoklonalni antitijelo trastuzumab; 2) tetrapeptidni GGFG molekule tipa koji se cijepi katepsinom B; 3) derivati ​​kamptotecina s korisnom inhibicijom inhibicije topoizomeraze I. Korisni teret povezan je s cisteinom monoklonskog antitijela kroz vezuč, prosječne vrijednosti DAR-a od 8. Dopušteno za liječenje odraslih pacijenata s neresectabilnim ili metastatskim HER2-pozitivnim karcinomom dojke koji su prethodno primili najmanje dvije anti-HER2 terapije ,